产品内容： 
提取液：液体 110mL×1 瓶，4℃保存； 
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存； 
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前吸取 10mL 提取液加入充分溶解备用； 试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；用时每支加 1mL 双蒸水充分溶解备用； 
试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；用时每支加 500μL 双蒸水充分溶解备用。 
工作液：在 7.5mL 试剂二中加入 1mL 试剂三和 0.5mL 试剂四，可以根据比例现用现配。 
 
产品说明：
 ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME 催 化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO2，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢 的关键酶。ME 活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME 活性测定较多，已经成为抗氧 化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。 NAD-ME 催化 NAD+还原成 NADH，在 340nm 下测定 NADH 增加速率。 
试验中所需的仪器和试剂： 
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板 和蒸馏水 
 
操作步骤： 
一、粗酶液提取： 
1、细菌、细胞或组织样品的制备： 
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g 4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。 
组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置 冰上待测。 
2、血清（浆）样品：直接检测。 
 
二、测定步骤 
1、紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 
2、将试剂一在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）中保温 15min 左右。 3、操作表：   
试剂名称（μL）
 测定管
试剂一
200
工作液
90
样本
10
 将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96 孔 UV 板中混匀，在 37℃（哺乳动物）或 25℃ （其它物种），340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 5min 后的吸光度 A2，计算ΔA=A2-A1。 
 
注意事项： 
1、若 A2-A1 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。 
2、实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一 37℃或 25℃水浴放置。 3、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水， 将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。用 96 孔板做时尽量保持反应温度在 37℃或 25℃。 
4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。用 96 孔板做 时尽量做到样本反应时间一致。 
5、如果ΔA＜0.01，可将反应时间延长到 10 分钟。 
 
三、NAD-ME 活性计算： 
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 
1、组织中 NAD-ME 活力的计算: 
（1）按样本蛋白浓度计算： 
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 
NAD-ME（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(Cpr×V 样) ÷T=965×ΔA÷Cpr 
（2）按样本鲜重计算： 
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 
NAD-ME（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T =965×ΔA÷W 
2、细菌或细胞中 NAD-ME 活力的计算: 
（1）按样本蛋白浓度计算： 
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 
NAD-ME（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(Cpr×V 样) ÷T=965×ΔA÷Cpr 
（2）按细菌或细胞密度计算： 
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单 位。 
NAD-ME（U/10 4 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T=1.93×ΔA
3、血清中 NAD-ME 活力的计算: 
单位的定义：每 mL 血清在反应体系中每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 
NAD-ME（U/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷V 样÷T =965×ΔA V 反总：反应体系总体积，3×10 -4 L；
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L/mol/cm；d：比色皿 光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。 
 
b. 用 96 孔板测定的计算公式： 
将上述公式中的 d-96 孔板光径改为 0.9cm 进行计算。